氮肥的过度使用，正在带来严重的环境问题。通过生物固氮的研究来解决农业生产中面临的氮肥问题是实现农业绿色和可持续发展的重要研究方向。2025年10月31日，中文成人直播-黄色直播网址 杨建国课题组在微生物学权威期刊mBio上发表题为Genetic analysis of the NifM dependence of the nitrogenase iron proteins的研究论文，该研究纠正了此前对于固氮酶系统核心组分NifH蛋白中NifM催化位点的错误认识，为NifH蛋白的成熟机制提供了新的见解，该研究中鉴定到的不依赖于NifM的NifH蛋白在构建自主固氮农作物的研究中有潜在的应用价值。
NifH蛋白作为固氮酶的核心组分之一，承担着固氮酶辅因子FeMoco、P簇的成熟以及还原力供给等多种功能，其正确折叠对于整个固氮酶系统的功能性有着至关重要的作用。在一些固氮菌中，NifH蛋白的成熟依赖于NifM蛋白的催化。NifM蛋白包含一个PpiC异构酶结构域，该结构域作用于脯氨酸残基，催化脯氨酸的顺反异构，从而促进蛋白的折叠。在NifH蛋白中存在7个高度保守的脯氨酸残基，早期在棕色固氮菌中的研究表明NifH蛋白258位的脯氨酸残基是NifM的催化位点，该位点突变为丝氨酸后能摆脱对NifM的依赖。然而，通过我们的研究发现，P258位点突变为丝氨酸会导致NifH蛋白活性大幅下降，且不能摆脱对NifM蛋白的依赖。而P258位点突变为异亮氨酸、苏氨酸以及缬氨酸能够实现与野生型NifH相当的活性，但是依然需要依赖于NifM蛋白的催化。进一步，我们发现除了P256以外的6个高度保守的脯氨酸残基均可以被适当的氨基酸替代并保留功能性，且这些突变体的功能均需要依赖于NifM蛋白。因此，我们推测P256位点更可能是NifM蛋白的催化位点，该位点突变为任何氨基酸均导致NifH蛋白完全失活。基于此，我们提出了NifH蛋白256位点的脯氨酸残基可能经过两轮顺反异构的假设，然而受限于实验条件我们未能验证该假设。
另外，在大部分的固氮菌中，并没有鉴定到NifM的同源蛋白，但是这些固氮菌中的NifH蛋白依然保留了7个保守的脯氨酸残基，包括256位点的脯氨酸残基。对于这些固氮菌中的NifH蛋白的成熟是否需要NifM蛋白的参与或者内源包含PpiC结构域蛋白的参与依然是未知的。为了验证这类固氮菌中NifH蛋白的成熟是否需要依赖于PpiC结构域，我们选取了来自芽孢杆菌的NifH作为代表，在模式大肠杆菌底盘中进行验证。我们首先将大肠杆菌中包含PpiC结构域蛋白的编码基因ppiC、ppiD以及surA进行了单敲除以及组合敲除。最终发现在敲除所有包含PpiC结构域编码基因的大肠杆菌中，在没有NifM蛋白参与的条件下，来自芽孢杆菌的NifH依然能够正常发挥功能。证明了这类固氮菌中来源的NifH蛋白不需要依赖于NifM或PpiC结构域催化成熟。然而，这些NifH中P256位点是如何跨过能量壁垒，完成顺反异构依然需要进一步的研究。
中文成人直播-黄色直播网址 杨建国研究员为本论文通讯作者；中文成人直播-黄色直播网址 谢卓婷、蔡舒怡以及陈昊洋为论文的共同第一作者；中国农业大学孔姝媛和北京林业大学唐乐天参与了本研究；论文得到北京大学生命科学中文成人直播 、崖州湾国家实验室王忆平教授的支持。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划项目以及中文成人直播-黄色直播网址 的资助。
杨建国课题组常年招收博士研究生及博士后，欢迎对生物固氮以及合成生物学感兴趣的同学加入课题组！
原文链接：//journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.02642-25